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崔云云
, 曹越平
上海交通大学农业与生物学院, 上海 200240
CUI Yun-yun, CAO Yue-ping
文献标识码: 1671-9964(2016)01-0001-04
文章编号: 1671-9964(2016)01-0001-04
收稿日期: 2015-02-23
网络出版日期: 2016-01-20
版权声明: 2016 上海交通大学期刊中心 版权所有
基金资助:
作者简介:
作者简介: 崔云云(1988-), 女, 硕士生, 研究方向:大豆遗传育种, E-mail: kxmami@163.com;
通讯作者: 曹越平(1967-), 女, 博士, 教授, 博士导师, 研究方向:大豆遗传育种, E-mail:yuepingcao@sjtu.edu.cn
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摘要
大豆[Glycine max (L.) Merrill]是我国主要的粮食和油料作物, 但近年来由于大量进口美国的转基因大豆, 使我国的大豆生产严重萎缩。生物技术方法应用于改良大豆的农艺性状和产品质量以及对除草剂的耐受性, 特别是对草甘膦的耐受性这一个重要性状。本研究以东农50为受体, 采用农杆菌介导法, 将抗草甘膦基因G10-EPSPS基因转入到大豆中, 先后获得了3株T0代植株, 在T0代进行抗性鉴定后, 1株得到种子。试验通过对转基因后代的PCR检测、Western检测以及草甘膦抗性鉴定, 证明外源基因已整合到植物基因组中, 并在T0、T1和T2代稳定表达。本研究为转基因大豆育种提供了材料和数据。
关键词：
Abstract
Soybean (Glycine Max L.Merrill) is an important grain and oil crop in China.However its production has been seriously reduced due to large scale soybean import from US Methods of biotechnology have been applied to soybean for improvement of the agronomic traits and the quality of the product.One such agronomic trait important in soybean production is herbicide tolerance, in particular, tolerance to glyphosate herbicide.In this study, Agrobacterium-mediated method was used to introduce G10-EPSPS into soybean Dongnong 50.Three transgenic soybean plants were obtained.The obtained transgenic soybean plants were all resistant to glyphosate and 1 event expressed the resistance stably in T0, T1 and T2 generations.Molecular analysis by PCR and Western blot verified that G10-EPSPS was integrated into the soybean genome and inherited stably in T0, T1 and T2 generations.It would be helpful for further study and soybean breeding.
Keywords：
大豆作为主要的饲料及油料作物, 在世界范围内广泛种植[1]。至2012年, 全球大豆种植面积达到1亿hm2, 其中转基因大豆约占81%[2]。转基因技术可以改良大豆的农艺性状以及产品质量。目前对大豆进行转化的基因主要包括抗除草剂基因、抗虫基因、抗逆基因及其他改善大豆品质和提高大豆产量的基因等[3], 抗除草剂基因中以抗草甘膦基因应用较多。草甘膦, 其商品名称农达, 是一种内吸传导型、广谱灭生性的除草剂, 由于其结构简单、生产成本不高、低毒、安全等诸多优点而备受关注。草甘膦的除草性能优异, 极易被植物叶片吸收并传导至植物全身, 对一年生及多年生杂草都有很高的活性。抗草甘膦大豆的种植避免了多种除草剂同时使用, 减少了农药的使用和农民除草成本[3], 简化了栽培种植管理程序, 对环境影响较小。
草甘膦作为一种芳香族氨基酸合成过程中的抑制剂, 其主要作用靶标是EPSPS, EPSPS基因广泛存在于细菌、真菌和高等植物中, 而在哺乳动物中不存在[4]。通常来自细菌和高等植物EPSPS基因对草甘膦敏感, 目前已从假单胞菌PG2982、根癌农杆菌CP4、无色杆菌LBAA和金黄色葡萄球菌(Staphycoccus aureus)等中克隆到具有天然的草甘膦抗性EPSPS基因[5]。孟山都公司从农杆菌菌株CP4菌株中克隆获得CP4-EPSPS的基因, 并且研制出商品名Roundup Ready Soybean(抗草甘膦大豆)的耐除草剂转基因大豆[6]。由于CP4-EPSPS基因有高抗草甘膦的特性, 目前是使用最广泛的抗性基因。此外, 还有可以使草甘膦快速代谢降解成无毒化合物的基因, 转基因植物也表现出一定的草甘膦抗性[7]。
目前在全世界范围内种植的抗草甘膦作物均为国外专利品种, 因此研发拥有我国独立自主产权的抗草甘膦作物仍为首要任务[8]。本实验用的G10-EPSPS基因是浙江大学沈志成教授从耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans R1)中克隆的EPSPS基因, 该基因具有我国自主知识产权并且有较强的草甘膦抗性。我们将G10-EPSPS基因导入大豆, 并对后代的抗性及遗传稳定性进行研究, 为培育我国抗除草剂转基因大豆提供材料。
本实验所用大豆受体为东农50, 由东北农业大学李文滨教授提供; 所用的农杆菌菌株和载体分别为菌株EHA105和PSOY19(含有目的基因G10-EPSPS), 由浙江大学寿惠霞教授提供; 抗体由浙江大学沈志诚教授提供。实验所用除草剂为美国孟山都公司研发生产的41%草甘膦异丙胺盐水剂(农达)。快速质粒小提试剂盒(DP105)、琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP209)、BCIPNBT底物显色试剂盒(PA111)均购自天根生化科技有限公司。SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒(SK8141)和SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(SK8131)均购自上海生工生物工程有限公司。
1.2.1 农杆菌制备
取100 μL EHA105 甘油菌(含PSOY19质粒)均匀涂布在YEP固体培养基上, 28 ℃培养3 d。挑取单菌落, 于含卡那霉素和链霉素的50 mL YEP液体培养基中, 28 ℃、200 r/min培养。选取OD值为0.6~1.0之间的菌液侵染外植体。
1.2.2 转化方法
挑选表面光滑, 饱满且无病斑的大豆种子灭菌。取100粒无菌的大豆种子在50 mL无菌水中浸泡16 h。在超净工作台上将大豆种子取出, 用解剖刀沿种脐垂直对称将子叶切开, 去掉种皮。将培养好的菌液在4 ℃下, 4 000 r/min, 离心10 min后重悬。将外植体置于重悬的菌液中侵染30 min后取出, 切口向下平铺在共培养培养基上, 28 ℃暗培养4 d。共培养后, 胚轴留2 mm, 切面朝上, 与培养基成45°左右斜插入到诱导培养基中。25 ℃、18 h光照/6 h黑暗的条件下, 诱导30 d后将诱导芽从子叶上切下后转移到伸长培养基中。相同条件下培养, 待伸长芽长至3~5 cm时, 切下, 转移到生根培养基中。生根后将其转移到花盆中(蛭石:珍珠盐:草炭为1:1:3), 培养箱中培养7 d后转移到人工气候室中培养。
1.3.1 转基因大豆的PCR检测
用CTAB法小量提取转基因植株和非转基因受体植株叶片的DNA进行PCR检测。PCR反应程序为:首先94 ℃预热5 min后设置32个循环(94 ℃解链30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延长1 min); 循环结束后72 ℃保持10 min; 最后降温至4℃反应结束。所用上游引物为:CCGATTACCCTGATTCC-CTTG, 下游引物为:AATCGGCGGTCTCTCTT-GCTC; 其PCR产物大小为725 bp。PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳30 min后取出, 在凝胶成像分析系统中成像并保存。
1.3.2 抗草甘膦转基因大豆植株的Western检测
分别T1代取植株根、茎、叶、花、荚各0.3 g, 在液氮中迅速研磨后转移至1.5 mL离心管中, 加入1 mL蛋白提取液混合均匀后, 4 ℃、12 000 r/min离心10 min, 取上清液备用。SDS-PAGE电泳后将蛋白质转移到PVDF膜上。将膜在PBST(2.5g脱脂奶粉+50 μL PBS溶液+1% Tween20)中室温封闭2 h后, 放入到一抗溶液(G10-EPSPS抗体:PBST=1:2000)中, 4 ℃孵育过夜; 第2天用新鲜PBST洗膜3次, 每次15 min; 将膜放置在二抗(0.5%BSA:PBST= 1:4000)中, 室温震荡孵育2 h; 再次洗膜2次, 晾干后在显影液(1 mL 1×AP反应缓冲液、50 μL NBT和50 μL BCIP)中对PVDF膜显影, 晾干后拍照。
1.3.3 转基因植株抗性鉴定
在人工气候室当T0代、T1代转基因大豆幼苗及T2代部分转基因植株幼苗的第1片复叶展开时进:150用水稀释后用手持式压力喷雾器均匀喷施, 观察幼苗的生长情况。
2.1.1 T0代转基因植株的获得
采用农杆菌介导法将G10-EPSPS基因转入到受体东农50中, 共获得3株T0代转基因植株(图1)。其中2株成熟期出现肉荚, 未正常结实; 另外1株在人工气候室遭受白粉病和红蜘蛛虫害, 移栽到大田后最终获得1粒种子。
图1 大豆转化的部分转化时期注: A:共培养时期; B:诱导时期; C和D:伸长时期; E移栽时期
Fig.1 Different periods of soybean transformationNote: A:co-cultivation; B:induction; C, D:elongation; E:T0 transgentic plant
2.1.2 T0代植株的抗性鉴定结果
T0代植株在人工气候室生长稳定后, 按照1.3.3所述方法和剂量喷施草甘膦, 观察植株生长情况。1 d后叶片出现铁锈状斑点, 3 d后观察发现症状并未加重, 7 d后基本恢复正常生长, 而对照植株3 d后叶片开始萎蔫, 7 d后全部死亡。结果表明T0代转基因植株具有良好的抗性。
2.1.3 T0代植株PCR检测结果
分别提取受体东农50和T0代植株叶片的DNA。以受体DNA作为阴性对照模板, 以农杆菌质粒作为阳性对照模板, PCR结果如图2。3株T0代植株1、A、A2均扩增出了725 bp大小的目的条带, 初步证明G10-EPSPS整合到了大豆东农50基因组中。
2.2.1 T1代植株抗性鉴定结果
将T0代植株所得的种子在人工气候室种植后, 正常出苗。在第1片复叶展开时, 按照1.3.3所述方法和剂量喷施草甘膦, 观察植株生长情况。结果发现T1代植株在喷施初期在喷施的叶片上现铁锈状斑点, 新长出的叶片正常, 植株正常生长且生长旺盛。在成熟期共得到68个荚, 总粒数161粒, 豆粒光滑饱满(图3)。结果表明T1代转基因植株具有良好的抗性。
图2 T0代PCR检测注: M: Marker DL2000; 1、A、A1、A2:T0代植株; CK+:阳性对照; CK-:阴性对照
Fig.2 PCR detection for T0.Note: M: Marker DL2000; 1, A, A1, A2:Transformation plants; CK+:Positive control; CK-:Negative control
2.2.2 T1代转基因植株Western检测结果
提取T1代植株根、茎、叶、花、荚的总蛋白, 将蛋白经SDS-PAGE电泳后转移至NC膜上, 以Rabbit Anti-G10多克隆抗体为一抗, Goat Anti-rabbit IgG HRP为二抗, 经western检测结果如图4。从图中可以看到很明显的条带, 且条带大小在46 kDa左右, 与目的条带大小一致。结果表明, 目的基因在转基因后代植株的各组织器官中均有表达, 茎、叶部表达量较多, 其次为花、荚和根。
图4 植株不同器官Western blot 检测结果注: M: Marker; 1:阴性对照; 2:根部; 3:茎部; 4:叶; 5:花; 6豆荚; 7:阳性对照
Fig.4 Western blot analysis of different tissuesNote: M: Marker; 1:Negative control; 2:root; 3:stalk; 4:leaf; 5:petal; 6:pod; 7:Positive control
在人工气候室种植部分转基因T2代植株, 在第1片复叶展开后, 按照1.3.3所述方法和剂量喷施草甘膦, 观察植株生长情况。7 d后对照植株死亡, 在喷施1 d后叶片出现铁锈状斑痕, 3 d后观察症状没有加重, 7 d后症状消失恢复正常生长。部分植株在喷施草甘膦7 d后死亡说明T2代有抗性分离(图5), 说明上一代的T1植株为杂合体。实验结果表明T2代转基因植株具有良好的抗性, 该转化体的抗性能够稳定遗传。
本实验将抗草甘膦基因G10-EPSPS转入到大豆品种东农50中, 先后获得了3株T0代转基因植株, 在喷施草甘膦后均具有较好的抗性。对一个转化事件的T0代、T1代和T2代植株喷施草甘膦, 在各代均表现出较好的抗性且抗性稳定遗传。对抗草甘膦转基因大豆T0代、T1代和T2进行PCR检测, 结果表明G10-EPSPS整合到大豆中, 且在转基因后代中稳定遗传。对T1代植株的根、茎、叶、花和荚进行Western blot检测, 结果表明目的蛋白在后代植株各个组织器官中均有表达。
图5 部分转基因T2代植株草甘膦抗性鉴定注:A、B、C:转基因植株; CK:对照植株
Fig.5 Identification of some transgenic glyphosate - resistant soybean T2 plantsNote: A, B, C:transgenic T2 plants; CK:Negative control
本研究得到的3株抗草甘膦转基因大豆, 2株未能正常结实。这种现象可能是因为对草甘膦抗性较弱有关或者与外源基因整合到染色体上的位置有关系[9]。Western检测结果表明目的基因在T1代植株的根、茎、叶、花和荚中均有表达。由于T1代要尽可能多的保留种子, 本研究没有测定成熟种子中蛋白的表达量。此外, 本研究对抗草甘膦转基因大豆的T0、T1和T2进行抗性鉴定, 证明抗性基因能够在转基因大豆各世代稳定遗传。在对T2代的抗性鉴定中发现, 部分植株在喷施草甘膦后表现为抗, 但是最终死亡, 这种现象可能与基因的插入位点和拷贝数有关, 还需要进一步研究。本研究草甘膦的喷施时期为第一个三出复叶展开时, 而实际生产中农民使用草甘膦的时间要比该时期晚一些。本研究利用农杆菌介导法将G10-EPSPS基因转入东农50, 获得了抗草甘膦转基因大豆新材料, 该材料可提供给国内的育种单位作为育种的中间材料。
The authors have declared that no competing interests exist.
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Genome sequence of the palaeo polyploid soybean [J]. |
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作物抗草甘膦转基因研究概况 [J].DOI:10.3969/j.issn.1001-7283.2007.04.003 URL [本文引用: 1] 摘要
草甘膦是一种非选择性除草剂,其作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）的活性.该合成酶是真菌、细菌、藻类、高等植物体内芳香族氨基酸生物合成过程中一个关键酶.自从1976年美国孟山都公司的草甘膦类除草剂-农达（Roundup）研制成功并得到广泛应用以来,作物抗草甘膦转基因研究成为抗除草剂基因工程研究的热点.随着抗草甘膦基因克隆的发展,抗草甘膦转基因作物也相继问世并大面积推广应用.对草甘膦作用机理、抗草甘膦基因（EPSPS编码基因）的研究、抗草甘膦作物遗传改良的策略及抗草甘膦转基因作物的推广应用情况进行综述,并简单分析了我国作物抗草甘膦转基因存在的问题及解决途径.
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世界抗草甘膦大豆的新进展 [J].DOI:10.3969/j.issn.1006-0413.2007.02.001 URL [本文引用: 2] 摘要
从1996年开始种植抗草甘膦大豆以来,农民迅速接受,种植面积持续扩大,其主要原因在于抗草甘膦大豆为农民提供了一种简而易行的除草方法,应用草甘膦既可防除大多数阔叶与禾本科杂草又不伤害后茬作物.抗草甘膦大豆促使苗后杂草防除,有利于实施免耕及窄行密植以提高产量.
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Amino acid biosynthesis inhibitors as herbicides [J]. |
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A new type of class I bacterial 5-enopyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutants with enhanced tolerance to glyphosate [J].DOI:10.1016/S0887-8994(00)00258-7 URL PMID: 11731078 [本文引用: 1] 摘要
Glyphosate or Roundup 03 is the most extensively used herbicide for broad-spectrum control of weeds. Glyphosate inhibits 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS), a key enzyme in the aromatic amino acid biosynthetic pathway in microorganisms and plants. Applying the staggered extension process, we randomly mutated and recombined the aroA genes of Salmonella typhimurium and Escherichia coli to obtain four variants that exhibit significantly enhanced tolerance to glyphosate. All four mutants are chimeras of the two parental genes and, in addition, three of them carry one or more de novo point mutations. None of the amino acid substitutions in the mutants was in a position previously known to be important for catalysis or substrate binding. Kinetic analysis of EPSPS activity from these mutants indicated that the tolerance was attributed to a 2–10-fold increased specific activity, 0.4–8-fold reduced affinity to glyphosate, and 2.5–19-fold decreased K m for phosphoenolpyruvate. Such mutants will be instrumental for the structural and function study of the enzyme and for the generation of transgenic crops resistant to the herbicide.
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Roundup Ready 大豆外源 CP4-EPSPS 蛋白及内外源基因在食品加工过程中的降解变化规律 [D] . |
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Glyphosate-tolerant CP4 and GOX genes as a selectable marker in wheat transformation [J].DOI:10.1007/BF00193711 URL PMID: 24185767 [本文引用: 1] 摘要
Abstract The lack of alternative selectable markers in crop transformation has been a substantial barrier for commercial application of agricultural biotechnology. We have developed an efficient selection system for wheat transformation using glyphosate-tolerant CP4 and GOX genes as a selectable marker. Immature embryos of the wheat cultivar Bobwhite were bombarded with two separate plasmids harboring the CP4/GOX and GUS genes. After a 1 week delay, the bombarded embryos were transferred to a selection medium containing 2 mM glyphosate. Embryo-derived calli were subcultured onto the same selection medium every 3 weeks consecutively for 9-12 weeks, and were then regenerated and rooted on selection media with lower glyphosate concentrations. Transgenic plants tolerant to glyphosate were recovered. ELISA assay confirmed expression of the CP4 and GOX genes in R0 plants. Southern blot analysis demonstrated that the transgenes were integrated into the wheat genomes and transmitted to the following generation. The use of CP4 and GOX genes as a selectable marker provides an efficient, effective, and alternative transformation selection system for wheat.
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大豆外源基因逃逸生态风险评价[D] . |
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插入T-DNA片段构建部分水稻突变体株系 [J].
通过农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导,将T-DNA片段高效插入水稻中花11的基因组DNA中。利用二次枝梗种子和未成熟种子的盾片愈伤组织作为转化起始物,探索并优化了影响愈伤组织诱导率、再生率和转化率的试验条件,得到近10 000株转化植株。经PCR分析和Southern 杂交证明已将外源基因整合到水稻基因组中。当代转基因植株可抗0.2%的除草剂Basta。200余棵T0代转化株系出现白化苗、宽叶、狭叶、黄叶、高秆、矮化并杂草化、不育、白化穗、皱穗和抽穗延迟等突变表型,结实率普遍较低
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Guidelines for the validation and use of immunoassays for determination of introduced proteins in biotechnology enhanced crops and derived food ingredients [J].DOI:10.1603/0022-0493(2007)100[54:MOMRBL]2.0.CO;2 URL 摘要
Recent advancements in agricultural biotechnology have created a need for analytical techniques to determine introduced proteins in crops enhanced through modern biotechnological techniques. These proteins are expressed in plant tissues and may be present in food ingredients. Immunoassays are ideally suited for protein detection and may be used as both quantitative and threshold methods. Microplate ELISA and lateral flow devices are two of the most commonly used immunoassay formats for agriculturalbiotechnology applications. This paper provides general background information and a discussion of criteria for the validation and application of immunochemical methods to the analysis of proteins introduced into plants and food ingredients using biotechnology. It is the result of a collaborative effort of members of the Analytical Environmental Immunochemical Consortium. This collaborative effort represents the combined expertise of several organizations to reach consensus on establishing guidelines for the validation and use of immunoassays. Further, the paper offers developers and users a consistent approach to adopting the technology as well as aid in producing accurate and meaningful results.
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