外科理论与实践

外科理论与实践 ›› 2006, Vol. 11 ›› Issue (01): 49-53.doi: 10.16139/j.1007-9610.a1551

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hVEGF_(165)单克隆工程细胞的筛选和鉴定

叶展, 李劲松, 赵涵芳, 陈诗书,   

  1. 上海交通大学医学院生化与分子生物学教研室,上海交通大学医学院生化与分子生物学教研室,上海交通大学医学院生化与分子生物学教研室,上海交通大学医学院生化与分子生物学教研室 上海200025,上海200025,上海200025,上海200025
  • 发布日期:2020-07-25

  • Published:2020-07-25

摘要： 目的:用基因工程方法改造成纤维细胞,筛选出能够持续分泌人血管内皮细胞生长因子(hVEGF165)的细胞株,为难于愈合创面(如糖尿病性慢性溃疡)的治疗提供有效方法。方法:将含有hVEGF165的穿梭质粒pCDNA3-hVEGF165导入NIH3T3细胞,使用G-418根据有限稀释法筛选出7个单克隆细胞株。挑选出整合有hVEGF165基因且表达最高的一个细胞克隆在DNA、mRNA和蛋白质水平进行鉴定,同时使用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)、鸡胚实验检测表达产物的生物学活性。结果:PCR和Southern印迹证明hVEGF165基因已整合入NIH-3T3细胞基因组,RT-PCR和Northern印迹则表明该细胞株能够表达hVEGF165-mRNA。用hVEGF165-ELISA法证实在蛋白质水平该细胞株能够持续表达hVEGF165 3个月以上,并始终保持非常高的水平。MTT实验显示其具备较强的促进内皮细胞增殖的功能,而鸡胚实验则表明该工程细胞有很强的促进胚胎血管生成的作用。结论:成功地制备了hVEGF165单克隆工程细胞,为创伤愈合的基因治疗提供实验准备。

关键词: 血管内皮生长因子, 人, 克隆细胞, 基因疗法

Key words: hVEGF165, Monoclonal engineering cell, Gene therapy