诊断学理论与实践 ›› 2007, Vol. 6 ›› Issue (05): 422-426.doi: 10.16150/j.1671-2870.a0931
王海嵘, 顾春红, 钟璐, 钟济华, 韩洁英, 陈芳源, 欧阳仁荣,
摘要： 目的:构建并鉴定凋亡相关基因——PNAS-2的短发夹RNA(shRNA)质粒表达载体,将其转染U937细胞,筛选后检测细胞凋亡的变化。方法:shRNA质粒载体pRNAT U6.1/NEO经限制性内切酶BamHⅠ及HindⅢ双酶切后,连接带有BamHⅠ及HindⅢ黏性末端的shRNA插入片段,转化感受态细菌,并行测序鉴定。将阳性shRNA质粒载体进行细胞转染,合并使用G418及流式细胞仪(FCM)筛选出GFP阳性细胞,应用半定量PCR鉴定shRNA封闭效果;用Annexin V-APC/7-AAD标记后,使用FCM及激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡。结果:测序鉴定证实,PNAS-2特异的shRNA质粒表达载体构建正确;合并使用G418及FCM分选出GFP阳性细胞后,半定量PCR鉴定示shRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ组对PNAS-2的抑制率分别为78.1%、75.4%及51.4%。FCM显示shRNA对照组的细胞凋亡率为(3.52±1.25)%;而shRNAⅠ组为(9.23±1.88)%(P<0.01);shRNAⅡ(8.85±1.80)%(P0.05)。激光共聚焦显微镜观察显示,shRNA对照组细胞凋亡率为7.3%;shRNAⅠ组为14.7%;shRNAⅡ为13.8%;shRNAⅢ为10.3%。结论:测序结果表明,本研究成功构建了PNAS-2的shRNA质粒表达载体。半定量PCR显示shRNA抑制PNAS-2表达效果佳;抑制PNAS-2后可促使细胞凋亡,提示该基因是抗细胞凋亡基因。
